BOUTIQUE精品展示
蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot,WB)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。
WB實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會出現(xiàn)各種問題,得到不完美的結(jié)果。西美杰代理的SeraCare(KPL)品牌做為世界知名免疫學(xué)產(chǎn)品供應(yīng)商擁有近40年的產(chǎn)品研發(fā)經(jīng)驗(yàn),對WB實(shí)驗(yàn)有一定深入的了解,今天就為廣大客戶分享和總結(jié)WB中常見問題和解決辦法。
問題 |
可能原因 |
解決辦法 |
轉(zhuǎn)膜不充分導(dǎo)致信號較弱 |
膜沒有完全均勻濕透 |
使用100%甲醇浸透膜 |
靶蛋白分子量小于10000 |
選擇小孔徑的膜,縮短轉(zhuǎn)移時間 |
|
靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液PH值 |
嘗試使用其他緩沖液 |
|
甲醇濃度過高 |
降低甲醇濃度或者使用乙醇/異丙醇替代 |
|
轉(zhuǎn)移時間不夠 |
對于厚的膠以及高分子量蛋白質(zhì)需要延長轉(zhuǎn)移時間 |
|
洗膜不充分 |
增加洗液體積和洗滌次數(shù) |
|
阻斷不充分 |
增加封閉液孵育時間,或者提高溫度。 |
|
二抗?jié)舛?/span>過高 |
降低二抗?jié)舛?/span> |
|
檢測過程中膜干燥 |
保證充分的反應(yīng)液 |
|
曝光過度 |
縮短曝光時間 |
|
抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng) |
檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性,選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng) |
|
沒有陽性條帶或條帶信號較弱 |
抗體染色不充分 |
增加抗體濃度,延長孵育時間 |
酶活降低甚至失活 |
直接將酶和底物進(jìn)行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi),有活性的酶聯(lián)物 |
|
標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
設(shè)置陽性對照,如果陽性對照有結(jié)果,但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因 |
|
試劑不匹配 |
一抗與組織種屬,一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級檢測系統(tǒng)的有效性 |
|
一抗失效 |
選擇在有效期內(nèi)抗體,并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液 |
|
洗膜過度 |
縮短洗滌時間 |
|
HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 |
|
抗體活性降低 |
選擇在有效期內(nèi)的抗體,工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,避免長時間放置 |
|
蛋白轉(zhuǎn)移不充分 |
見上述 |
|
封閉過度 |
減少封閉劑的量或縮短時間,換用不同封閉劑類型 |
|
曝光時間過短 |
延長曝光時間 |
|
條帶位置(大小)不對,或有非特異性條帶 |
二抗的非特異性結(jié)合 |
增加一個對照:不加一抗,其他操作過程不變,即可驗(yàn)證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗(特異性更強(qiáng)的,只針對重鏈的) |
一抗的特異性不夠 |
使用單克隆或者親和純化的抗體,保證抗體的特異性 |
|
蛋白降解 |
使用新鮮制備的標(biāo)本,并使用蛋白酶抑制劑,實(shí)驗(yàn)中增加內(nèi)參 |
|
蛋白二聚體或多聚體存在 |
增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度 |
|
抗體濃度過高 |
降低抗體濃度,可以減少非特異性條帶 |
|
蛋白上樣量過大 |
降低樣本上樣量 |
|
背景斑駁 |
封閉劑中有聚集體 |
使用前過濾封閉劑 |
HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體 |
過濾二抗試劑,去除聚集體 |
|
膜上出現(xiàn)反像 |
HRP含量過高 |
降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
西美杰代理的SeraCare(KPL)品牌是專業(yè)親和純化二抗和底物顯色系統(tǒng)生成商,能為廣大診斷企業(yè)、科研用戶提供600多種二抗,覆蓋20多個物種,18種標(biāo)記,具有高純度、特異性強(qiáng)、批間穩(wěn)定等特點(diǎn),產(chǎn)品經(jīng)過ISO90001質(zhì)量體系認(rèn)證。
如果您要咨詢一抗、二抗、底物、輔助試劑等免疫相關(guān)產(chǎn)品信息,歡迎隨時撥打SeraCare(KPL)中國總代理北京西美杰科技有限公司客服熱線400-050-4006或登錄官網(wǎng)www.chxz.org.cn查詢訂購。